需中和80%之感染。其結(jié)果指出， ibal izumab藉由位組機制阻斷HIV-1進(jìn)入，并提供一策略性置入N-連結(jié)聚糖化位點能夠如 何被用于改進(jìn)單克隆抗體活性的實例。
[0092] 基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，其指出糖附加（glycan-addition)方法可用于提升單克隆抗 體的功能活性。利用結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（structural-activity relationship，SAR)，可想象 在抗體關(guān)鍵位置上增加體積可改進(jìn)活性，以產(chǎn)生優(yōu)選的單克隆抗體產(chǎn)物。
[0093] 在本發(fā)明之一些【具體實施方式】中，其可能需要產(chǎn)生實質(zhì)上同質(zhì)的N-連結(jié)聚糖類 抗體或同一類型N-連結(jié)聚糖類。「實質(zhì)上同質(zhì)」一術(shù)語是指在抗體分子制備物上有至少 50%、60%、75%、80%、85%、90%或甚至95%之^連結(jié)聚糖類具有相同結(jié)構(gòu)、相同大小 (也就是相同分子量，或者，相同數(shù)量之糖「環(huán)」），或相同范圍之大?。ɡ纾?-12個「環(huán)」、 或10-11個「環(huán)」）及/或種類。此目的可藉由使用基因工程細(xì)胞株以表達(dá)或過度表達(dá)一組 經(jīng)選取涉及N聚糖化的酵素（請見，例如，美國專利號6, 602, 684及美國專利號7, 029, 872， 在此通過引用并入本案以作為參考文獻(xiàn)），或于N聚糖化作用途徑之中間階段破壞酵素（例 如，GnTl剔除細(xì)胞株），或使用一個或一個以上的標(biāo)靶特定加工酵素之抑制劑，或其組合來 達(dá)成。抑制劑之實例包括Kifunensine、DMJ(即「deoxymannojirimycin，脫氧甘露糖野尻 霉素」）及苦馬豆素（Swainsonine) 〇
[0094] 藥物組合物
[0095] 可藉由混合抗體和一個或一個以上的任選的藥學(xué)上可接受的載體以制備含有本 發(fā)明所公開的聚糖修飾抗體的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、分散介質(zhì)、等 張劑及其類似物。載體可為液體、半固體（例如，糊狀物），或固體載體。載體之實例包括 水、鹽類溶液或其他緩沖液（例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液）、油、醇類、蛋白質(zhì)（例如，血 清白蛋白、明膠）、糖類（例如，單糖、雙糖及其他糖類，包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、 甘露糖醇、山梨糖醇或糊精）、凝膠、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、多孔基質(zhì)、黏合劑、填充劑、涂料、 穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸、螯合劑如H)TA ;成鹽抗衡離子（salt forming counter-ions)如鈉離子；非離子型界面活性劑如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二 醇（polyethylene glycol，PEG)，或其結(jié)合物。
[0096] 藥物組合物可包含以大于一者的活性化合物（例如，一個或一個以上的抗體）結(jié) 合一個或一個以上的額外之有益化合物以抑制、預(yù)防及治療HIV感染。
[0097] 可由任選的便利及實際的方式結(jié)合活性成分及載體，例如藉由混合物、溶液、懸浮 液、乳化、包囊、吸收及其類似物，并可制成適于注射、攝入、輸注或其類似物的制劑，例如錠 劑、膠囊、粉末（包括凍干粉末）、糖漿及懸浮液。亦可制成緩釋制劑。
[0098] 治療及預(yù)防之方法
[0099]另一方面，本文所公開的聚糖修飾的抗體，任選地配合藥學(xué)上可接受的載體來供 應(yīng)，是應(yīng)用于治療及預(yù)防個體的HIV感染，以及預(yù)防HIV的傳輸。
[0100] 本文使用的HIV感染之「治療」一術(shù)語是指有效抑制HIV感染以延遲發(fā)病、減緩進(jìn) 展、降低病毒載量，及/或改善HIV感染造成之癥狀。
[0101] 本文使用的術(shù)語「HIV感染預(yù)防」是指延遲HIV感染的發(fā)生，及/或降低或消除HIV 感染的發(fā)生率或可能性。
[0102] 本文使用的術(shù)語「HIV傳輸預(yù)防」是指降低或消除HIV由一個體傳輸至另一個體之 發(fā)生率或可能性（例如，懷孕、分娩或生產(chǎn)期間由HIV陽性母體傳輸至胎兒，或母乳哺育；或 由HIV陽性個體傳輸至HIV陰性伴侶）。
[0103] 本文使用的術(shù)語「個體」是指任何靈長類動物個體，包括人類及非人類個體（例 如，恒河猴個體）。
[0104] 為抑制、治療及/或預(yù)防HIV感染，一本文所公開的聚糖修飾的抗體的治療有效量 是給藥于有需求的個體。
[0105] 本文使用的術(shù)語「治療有效量」是指HIV感染抑制所需的有效劑量以治療及/或 預(yù)防HIV感染。該抗體劑量取決于疾病狀態(tài)及其他臨床因素，例如個體的體重及條件、個體 對治療的反應(yīng)、制劑類型及給藥途徑。治療有效及無害的準(zhǔn)確劑量可為本領(lǐng)域之技術(shù)人員 所決定。常規(guī)上，成人的非腸道抗體給藥的合適劑量范圍為每日約〇. 1至20mg/kg病患體 重，每周一次或甚至每月一次，其中所使用的典型初始范圍為約2至10mg/kg。由于抗體最 終會在血流中清除，再次給藥可能是需要的?；蛘撸墒褂每刂漆尫呕|(zhì)以提供抗體輸注或 注射。
[0106] 抗體可由標(biāo)準(zhǔn)途徑給藥于個體，包括口服、透皮或非腸道（例如，靜脈、腹腔、皮 內(nèi)、皮下或肌內(nèi)）。此外，該抗體可由注射或手術(shù)移植或固位（attachment)導(dǎo)入體內(nèi)，因此 一顯著量的想要的抗體是能以控制釋放方式進(jìn)入血流的。
[0107] 序列表
[0108] SEQIDNO: 1 :人類⑶4受體的胺基酸序列（胺基酸1-25代表一信號肽、胺基酸 26-122構(gòu)成D1，以及胺基酸123-205構(gòu)成D2):
[0109]MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGS FLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLT LESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSIVYKKEGE QVEFSFPLAFTVEKLTGSGELffffQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYA GSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVffVLNPEAGM ffQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTffSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEK KTCQCPHRFQKTCSPI
[0110] SEQ ID NO:2 :MV1重鏈的胺基酸序列（471個胺基酸，包括前面19個胺基酸殘基 構(gòu)成的前導(dǎo)序列）：
[0111] MEWSGVFMFLLSVTAGVHSQVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHffVRQKPGQGLDffl GYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
[0112] SEQ ID NO:3 :MV1輕鏈的胺基酸序列（238個胺基酸，包括前面19個胺基酸構(gòu)成 的前導(dǎo)序列）：
[0113]
[0114] SEQ ID N0:4 :LM52輕鏈的胺基酸序列：
[0115] DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAffYQQKPGQSPKLLIYffANSTESGYPDRFS GSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0116] SEQ ID NO: 5 :具有改進(jìn)的抗體再利用性的經(jīng)修飾MV1重鏈的胺基酸序列（452個 胺基酸，其中有二個修飾位置）：
[0117] QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKAT LTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK*
[0118] -些特定【具體實施方式】的說明目的在提供足夠的信息，使他人可利用現(xiàn)今之知識 而易于變更或修改并進(jìn)行各種應(yīng)用，那些特定【具體實施方式】未背離通用概念，因此那些修 改或變更應(yīng)該且目的在于所公開的【具體實施方式】的相當(dāng)意義和范圍內(nèi)能充分理解。應(yīng)理解 的是，本文所使用的用語或術(shù)語的目的在于說明而不是局限。在圖示及說明中，揭示了示例 性【具體實施方式】，雖然可能使用特定術(shù)語，除非有特別指明，僅為通用及描述意圖且目的并 非在于局限，因此本發(fā)明主張的范疇不受局限。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是本文提 到的方法的某些步驟可能會以另一順序編排或步驟可能重新組合。因此，本發(fā)明所附的權(quán) 利要的目的不是為了局限于所公開的【具體實施方式】。
[0119] 實施方式
[0120] 材料及方法
[0121] 1.細(xì)胞株、試劑、及假型病毒
[0122] TZM-bl細(xì)胞（目錄編號8129)取自美國國家衛(wèi)生研究院（NIH)過敏與傳染性疾病 國家研究所（NIAID)AIDS部門的AIDS研究與參考試劑計劃（AIDS Research and Reference Reagent Program，ARRRP)。所述細(xì)胞為經(jīng)基因工程之HeLa細(xì)胞株，其表達(dá)CD4、CXCR4及 CCR5并含有對Tat反應(yīng)的報導(dǎo)子（Tat-responsive reporter)基因以用于在HIV-1長 末端重復(fù)序列的控制下啟動熒光素酶和半乳糖苷酶。來自急性及早期感染的B亞型 HIV-1包膜選殖株及包膜缺失骨架質(zhì)粒（SG3 A Env)之標(biāo)準(zhǔn)參考規(guī)模（Standard Reference Panels)亦取自NIH ARRRPAIV-1包膜假型病毒是以具有包膜表達(dá)質(zhì)粒及SG3Aenv之293A 細(xì)胞（Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染所制備。含有人類⑶4的全長細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組型s⑶4獲 自于 Progenies Pharmaceuticals, Inc. (Tarrytown, NY) 〇 Ibalizumab 蛋白質(zhì)是由 TaiMed Biologics(Irvine,CA)所提供。質(zhì)粒pMVl及pLC，分別編碼ibalizumab H鏈及L鏈，是由 cDNA所放大（amplified)并選殖至pO)NA3. 1(+) (Invitrogen)。N-乙?；咸烟前忿D(zhuǎn)移酶 I-陰性GnTl (-)人類胚胎腎臟（HEK) 293S細(xì)胞是取自ATCC (目錄編號CRL-3022)。
[0123] 2.將N-連結(jié)聚糖化位點加至抗-⑶4抗體L鏈
[0124] 藉由突變作用導(dǎo)入厶811-厶1&-11^(11〇0￡、11153、11154、11160、11165、11167與11176)或 Asn-Ser_Thr(LM52)序列以在如WT ibalizumab或MV1的抗-0)4抗體的輕（L)鏈建立突變 體。突變作用是以Quikchange突變作用試劑盒（Stratagene，Santa Clara，VA)所進(jìn)行。該 L(輕）鏈突變體（LM)構(gòu)建體是由抗-CD4IgGl抗體（例如，MV1)所產(chǎn)生，且隨即進(jìn)行定序 并利用聚乙稀亞胺（polyethylenimine，PEI)_DNA復(fù)合體短暫轉(zhuǎn)染至HEK293A細(xì)胞（重鏈 與輕鏈質(zhì)粒的比例為1:1)。在轉(zhuǎn)染后第