s改進(jìn)的HIV-1中和活性。此研究針對LM52,因 其具有優(yōu)異的HIV-1中和作用情況（圖7)。要產(chǎn)生一缺少任何N-連結(jié)聚糖之LM52型， 293A細(xì)胞以LM52構(gòu)建體短暫轉(zhuǎn)染之后，立即加入衣霉素（tunicamycin)，其抑制GlcNAc磷 酸轉(zhuǎn)移酶。同樣地，為產(chǎn)生一標(biāo)記有10-11環(huán)糖（高M(jìn)an型之N-糖Man sGlcNAc2 (Man8)或 Man9GlcNAc2(Man9))的LM52,本發(fā)明將kifunensine加入293A細(xì)胞。最后，為產(chǎn)生一具有 7環(huán)糖（高甘露糖（Man)型N-糖Man 5GlcNAc2(Man5))的LM52,使用N-乙?；咸烟前忿D(zhuǎn) 移酶I-陰性GnTl (_)HEK293S細(xì)胞。如SDS-PAGE所示，雖然加入kifunensine不會明顯改 變L鏈的大小，加入衣霉素在GnTl(-)細(xì)胞的生長明顯減少L鏈的大?。▓D8A)。同樣地， 相較于kifunensine存在下所產(chǎn)生之抗體，在衣霉素存在下或生長于GnTl (-)細(xì)胞所產(chǎn)生 的抗體對于三種HIV-1病毒株的中和活性更嚴(yán)重降低（圖8B)。因此，當(dāng)L鏈殘基52存在 較大之聚糖類時，其觀察到較強的HIV-1中和活性。仿真結(jié)果顯示較大聚糖類較易置入L 鏈與gpl20之間的空間（圖4C)，然而聚糖的支鏈本質(zhì)亦可影響LM52的HIV-1中和活性。
[0152] 實施方式5. LM52的中和廣度及功效
[0153] 本發(fā)明接著檢測LM52對于一組涵蓋11個分支之118株不同HIV-1病毒株的HIV-1 中和活性。在此單循環(huán)TZM-bl試驗中，相較于WT ibalizumab，LM52顯示明顯改進(jìn)的中 和廣度及功效（圖9及表3)。LM52對于陰性對照組病毒（鼠白血病病毒）不具中和活性 (表3)，不過其中和（其定義為彡50%之抑制作用）所有受測的HIV-1病毒株，對比于WT ibalizumab 92%的病毒株中和能力。事實上，LM52中和97%的病毒并達(dá)到彡95%抑制， 對比于訂讓&1丨211111 &13僅31%有此結(jié)果（圖5，上面部分）。針對所有118株病毒，11152亦 具有1(；。值〈0.11^/1^，對比于訂讓 &11211111&13對75%病毒有此結(jié)果（圖9，中間部分）。 的確，LM52中和所有的病毒且IC SQ〈0. 3 y g/mL，而有36%的病毒即使以濃度10 y g/mL之WT 讓31丨2111]^13中和仍未達(dá)80%之抑制功效（圖9，下面部分）。
[0154] 表 3 Ibalizumab 及 LM52 之體外中和情況，以 IC5。（ y g/mL)、ICS。（ y g/mL)及 MPI(% )表示
[0155]
[0156]
[0157]
[0158] 整體而言，LM52的IC5。幾何平均值為14ng/mL，對比于WT ibalizumab的74ng/mL， 以及LM52的IC8。幾何平均值為37ng/mL，對比于WT ibalizumab的510ng/mL (圖11) ^當(dāng)病 毒分為ibalizumab敏感性病毒株（MPI>80% )與ibalizumab抗性病毒株（MPI < 80% )時， 其明顯發(fā)現(xiàn)LM52的提升的功效在ibalizumab抗性病毒株最顯著（圖12) 在ibalizumab抗 性病毒方面，LM52之IC8。幾何平均值為50ng/mL，對比于WT ibalizumab的幾乎10, OOOng/ mL。即使是在ibalizumab敏感性病毒，LM52功效的提升約在3倍。
[0159] 所述LM52改進(jìn)活性亦可在比較其HIV-1病毒株覆蓋率相對于漸增的抗體濃度的 的比較圖中觀察得到（圖10)。針對WT ibalizumab之活性改進(jìn)顯而易見，并優(yōu)于已知具 有廣域及有效HIV-1中和活性的mAbs (PG9、VRC01、10E8及NIH45-46G54W)。LM52在所有濃 度>0. 01 y g/mL之情況下具有最大病毒覆蓋率，并于濃度低于0. 1 y g/mL時達(dá)到100%。只 有在濃度低于〇. 01 y g/mL時，LM52之覆蓋率不如NIH45-46G54W，一 gpl20上CD4結(jié)合位點 的人類mAb修飾型。然而，應(yīng)注意的是，ibalizumab藉由結(jié)合至⑶4以抑制HIV-1感染，而 VRC01、PG9、10E8及NIH45-46G54W藉由直接結(jié)合至病毒以抑制HIV-1感染。盡管如此，無 論是否這些mAbs結(jié)合于病毒包膜或⑶4,它們都以阻斷病毒進(jìn)入的方式中和HIV-1感染。
[0160] 實施方式6.多重糖類之效用
[0161] 本發(fā)明接著測定于ibalizumab L鏈之感興趣區(qū)域附加二或三種聚糖類的效 用。本發(fā)明于293A細(xì)胞產(chǎn)生LM30E-52、LM30E-53與LM52-67雙突變體，及LM30E-52-67 與LM30E-53-67三突變體，且隨即純化并以SDS-PAGE分析抗體（圖13A)。相較于WT ibalizumab或單突變體LMs，雙突變體之每一者可觀察到稍大的L鏈，且三突變體之每一 者可觀察到更大的L鏈。本發(fā)明接著探究這些變體mAbs對于一組已知完全或部分具有 ibalizumab抗性之HIV-1病毒株之HIV-1中和情況。一般而言，所述雙與三突變體所顯示 的中和活性可相較于LM52的活性（表4 ;圖13B，左邊部分）。事實上，ICS。幾何平均值顯 示相較于LM52,三突變體的功效可能稍低。唯一的例外在于SHIVsf 162P3N病毒，一種對于 雙與三突變體的敏感性高于對于LM52的病毒（表4 ;圖13B，右邊部分）。整體而言，本發(fā) 明沒有發(fā)現(xiàn)證據(jù)顯示附加一個以上的聚糖可進(jìn)一步改進(jìn)LM52對于ibalizumab敏感性病毒 的HIV-1中和情況。藉由附加第二種聚糖的LM52活性的改進(jìn)可能僅顯見于具有LM52抗性 或部分抗性的病毒。
[0162] 表4 Ibalizumab及其單、雙與三突變體LMs之ICSQ( y g/mL)的比較
[0163]
[0165] 實施方式7. LM52多重反應(yīng)性之分析
[0166] -些HIV-1中和性mAbs的常見特性為其和自體抗原的交叉反應(yīng)性。即使在濃度 為10yg/mL，LM52及ibalizumab皆無法結(jié)合至HEp-2上皮細(xì)胞萃取物（圖14A)。此外， LM52及ibalizumab皆未顯示與單股DNA、雙股DNA、胰島素、脂多糖或鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白 (keyholelimpethemocyanin，KLH)具有反應(yīng)性（圖 14B)。人類CD4 蛋白質(zhì)是ibalizumab 的預(yù)期標(biāo)的，是LM52僅能辨識的受測自體抗原。因此，本發(fā)明沒有發(fā)現(xiàn)證據(jù)顯示LM52對于 自體抗原具有多重反應(yīng)性。
[0167] 結(jié)論
[0168] 在本發(fā)明中，提供一種由MV1產(chǎn)生的優(yōu)異型HIV-1進(jìn)入阻斷性mAb產(chǎn)物，稱作變 體LM52,其在相對低之濃度下能中和所有受測之HIV-1病毒株。LM52之病毒中和特性明顯 優(yōu)于野生型ibalizumab及現(xiàn)今許多據(jù)報告最好的抗包膜mAbs，例如，VRC01、PG9、10E8及 NIH45-46G54W。結(jié)合已建立的ibalizumab人體安全記錄，這些觀察顯示LM52應(yīng)是發(fā)展臨 床上HIV-1治療或預(yù)防的良好選項。考慮預(yù)期的（根據(jù)習(xí)知親本ibalizumab的藥代動力 學(xué)特性）每月給藥時間表，此修飾的抗體可具體而言適合作為長效型PrEP試劑。
[0169] 該等發(fā)現(xiàn)亦提供對于ibalizumab作用機制之洞悉。也就是，HIV-1于gpl20 V5 之N端失去一個糖以變成具有ibalizumab抗性。結(jié)果顯示由糖調(diào)結(jié)的ibalizumab作用機 制導(dǎo)致抗體L鏈與病毒包膜聚糖蛋白之間的空間沖突（steric clash)，從而于空間上破壞 HIV-1進(jìn)入的步驟。本發(fā)明指出L鏈上的聚糖恢復(fù)ibalizumab對于ibalizumab抗性病毒 株的抗病毒活性，其中將此糖置于空間上最接近V5的關(guān)鍵殘基造成最大的抗病毒效用，以 及較大之聚糖類具有較大的病毒中和效用，其共同支持但非證明，ibalizumab經(jīng)由位組機 制阻斷HIV-1感染。
[0170] 所有公開和專利文獻(xiàn)、專利申請公開文獻(xiàn)，和本文所引用的專利申請在此通過引 用全部并入本文作為參考文獻(xiàn)，其范圍如同其中每一者單獨通過引用以并入本文作為參考 文獻(xiàn)。
【主權(quán)項】
1. 一種聚糖修飾的抗-CD4抗體，其包含一個或一個以上的N-連接聚糖，連接至該抗體 的可變區(qū)。2. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其中該一個或一個以上的N-連接聚糖連接至該抗體的輕 鏈可變區(qū)。3. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其中該抗-⑶4抗體為ibalizumab的一種修飾型，其在輕 鏈可變區(qū)包含一工程化的N-連接聚糖化位點。4. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其中該抗-CD4抗體為MVl的一種修飾型，其在輕鏈可變 區(qū)包含一工程化的N-連接聚糖化位點。5. 如權(quán)利要求4所述的抗體，其中該MVl為一抗-⑶4IgG1抗體，其具有如SEQID NO:2的重鏈胺基酸序列，和如SEQIDNO:3的輕鏈胺基酸序列。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體，其在該重鏈Fc區(qū)或FcRn區(qū)包含一個或一個 以上的修飾。7. 如權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體，其中該工程化的N-連接聚糖化位點位于選自 于由30E、52、53、54、60、65、67、76和其組合所組成的群組的該輕鏈的胺基酸位置。8. 如權(quán)利要求7所述的抗體，其中該工程化的N-連接聚糖化位點位于選自于由 30EGln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、67Ser、76Ser和其組合所組成的群組的該輕鏈 的胺基酸位置。9. 如權(quán)利要求8所述的抗體，其中該工程化N-連接聚糖化位點位于選自于由30EGln、 52Ser、53Thr、54Arg、65Ser和67Ser組成的群組的該輕鏈的胺基酸位置。10. 如權(quán)利要求9所述的抗體，其中該工程化N-連接聚糖化位點位于52Ser。11. 如權(quán)利要求10所述的抗體，其包含如SEQIDN0:4的輕鏈胺基酸序列。12. 如權(quán)利要求11所述的抗體，其包含如SEQIDN0:4的輕鏈胺基酸序列及如SEQID NO:5的重鏈胺基酸序列。13. -種聚糖修飾的抗-⑶4抗體，其包含如SEQIDNO:4的輕鏈胺基酸序列，和如SEQ IDNO:5的重鏈胺基酸序列。14. 如權(quán)利要求1-10中任一項所述的抗體，其中該N-連接聚糖類包含至少7個糖單 JL〇15. 如權(quán)利要求14中任一項之抗體，其中該N-連接聚糖類包含10-11個糖單元。16. -種包含編碼抗-CD4免疫球蛋白鏈的核酸序列的表達(dá)載體，其輕鏈可變區(qū)具有如 權(quán)利要求1-13中任一項所定義的工程化N-連接聚糖化位點。17. 如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其中該抗-⑶4免疫球蛋白鏈為ibalizumab的輕 鏈。18. 如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其中該抗-CD4免疫球蛋白鏈為MVl的輕鏈。19. 如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其包含編碼抗-CD4免疫球蛋白鏈的核酸序列，其 輕鏈可變區(qū)具有如權(quán)利要求11所定義的工程化N-連接聚糖化位點。20. -種宿主細(xì)胞，其以權(quán)利要求16-19中任一項所述的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)形。21. -種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-15中任一項所述的抗體和至少一藥學(xué)上可 接受的載體。22. -種抑制個體HIV感染的方法，其包含給藥于該個體一治療有效量的如權(quán)利要求 1-15中任一項所述的抗體。23. -種治療感染HIV的個體的方法，其包含給藥于該個體一治療有效量的如權(quán)利要 求1-15中任一項所述的抗體。24. -種預(yù)防個體HIV感染的方法，其包含給藥于該個體一治療有效量的如權(quán)利要求 1-15中任一項所述的抗體。25. -種預(yù)防HIV陽性懷孕個體傳染HIV病毒至胎兒的方法，其包含給藥于該個體一治 療有效量的如權(quán)利要求1-15中任一項所述的抗體。26. -種預(yù)防HIV陽性個體傳染HIV病毒至HIV陰性伴侶的方法，其包含給藥于該HIV 陽性個體或該HIV陰性伴侶一治療有效量的如權(quán)利要求1-15中任一項所述的抗體。27. -種具有改進(jìn)活性的聚糖修飾的單克隆抗體，其包含以N-連接糖類連接至該抗體 的可變區(qū)。28. 如權(quán)利要求27所述的抗體，其中該N-連接糖類連接至該抗體的輕鏈可變區(qū)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有N-連接聚糖類連接至可變區(qū)的聚糖修飾的抗-CD4單克隆抗體。本發(fā)明還公開了用于生產(chǎn)此類抗體的表達(dá)載體和細(xì)胞株，和此類抗體在HIV預(yù)防和治療的用途。本發(fā)明一般而言涉及HIV的預(yù)防和治療。本發(fā)明一般而言還涉及抗體的聚糖修飾。具體而言，本發(fā)明涉及用于HIV預(yù)防和治療的聚糖修飾的抗-CD4抗體。
【IPC分類】A61K39/395
【公開號】CN105228650
【申請?zhí)枴緾N201380073311
【發(fā)明人】R·宋, D·D·賀
【申請人】美國洛克菲勒大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2013年12月18日
【公告號】EP2934589A1, US20150166662, WO2014100139A1