5天收取上清液并以蛋白質(zhì)-A瓊脂糖（protein-A agarose) (Thermo Scientific, Rockford, IL)管柱純化 LM 蛋白。在進行 SDS-PAGE 分析之 前，于變性條件下以 PNGase F(New England Biolabs，Ipswich，MA)處理 WT ibalizumab 及 LM30E、LM52 與 LM53。
[0125] 3.利用TZM-bl細(xì)胞之病毒中和試驗
[0126] 中和試驗是根據(jù)Wei等人的方法（Wei et al.，Nature 422, 307-312,2003)并加 以修改以進行。簡單而言，細(xì)胞以每孔10, 〇〇〇個的數(shù)量種植于96孔盤，各孔內(nèi)含補充有 10%胎牛血清（D10)之100yL DMEM并整夜培養(yǎng)。隔日，將連續(xù)稀釋的ibalizumab或LM 蛋白加入該細(xì)胞培養(yǎng)基中并培養(yǎng)1小時。隨后，以含DEAE-聚葡萄糖（DEAE-Dextran)的 D10 (Sigma, St. Louis, M0)制備 200X 50% -組織-培養(yǎng)-感染-劑量（50%-tissue-cult ure-infective-doses，TCID5。）之具復(fù)制能力的或假型HIV-1，并加入前述細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時，并以 Galacto-Star 系統(tǒng)（Applied Biosystems，Cedarville，OH)測定 0 半乳糖苷 酶的活性。病毒感染力抑制百分比是以1減去經(jīng)抗體處理的孔與未處理的感染孔的比例再 乘以100所計算。利用非線性回歸分析計算IC 5。及1C 8。值（分別為具備50%及80%中和 作用的抗體濃度）。
[0127] 4.表面等離子體共振
[0128] 利用 Biacore T3000 光學(xué)生物感測儀（GE Healthcare, Piscataway, NJ)進行結(jié)合 親合性分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)胺親合（amine coupling)流程進行ibalizumab及所有聚糖變體的 固定化。簡而言之，以每分鐘5yL的流速將含有0. 2M N-(3-二甲基胺基丙基）-N-乙基碳 二亞胺（N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)與 0.05M N-羥基琥泊酰亞 胺（N-hydroxysuccinimide)的35yL溶液注入以活化感測芯片表面上的羧基。接著，將 ibalizumab或其突變體以pH 4. 5之10mM醋酸鈉緩沖液配制成2 y g/mL濃度，并以每分鐘 l〇yL的速度流過芯片表面直到反應(yīng)蛋白質(zhì)之反應(yīng)單位達到想要的程度（150-200RU)。將 未反應(yīng)的蛋白質(zhì)洗去之后，以每分鐘5 y L流速將35 y L之pH 8. 0的1M乙醇胺注入，以將感 測表面上過多活化的酯基加蓋（capped)。在相同條件下產(chǎn)生省略蛋白質(zhì)配體的參考物以作 為背景值校正儀器及緩沖液假數(shù)值。結(jié)合實驗是在25°C下于HBS-EP緩沖液（0. 01M HEPES、 0.15M NaCl、3mM EDTA、0. 005% vol/vol 界面活性劑 P20(GE Healthcare))進行。結(jié)合動 力學(xué)是以每分鐘30 y L流速將各濃度的分析物（人類sCD4蛋白）流過芯片表面3分鐘以 測定。芯片表面于第10分鐘的時，可偵測結(jié)合分析物之解離。以每分鐘50yL流速將pH 2. 0之10mM甘胺酸-HC1 (glycine-HCl)進行二次30秒之注入以移除殘存的分析物。在動 力學(xué)數(shù)據(jù)分析方面，利用BIAevaluation 4. 1軟件將局部覆蓋的感應(yīng)圖集體擬合至1:1朗 格謬爾結(jié)合模型（Langmuir binding model)以測定動力學(xué)參數(shù)。
[0129] 5. LM52上N-連結(jié)聚糖化之鑒定
[0130] 將 3 微克 LM52 蛋白質(zhì)溶于 50mM 碳酸氛錢（ammonium bicarbonate，ABC)/50% 四 氣乙?。╰etrafluoroethylene)，并加入 40mM 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT)以進行 還原反應(yīng)。在65°C下培養(yǎng)1小時后，加入40mM碘乙酰胺（iodoacetamide)，并在室溫下避 光反應(yīng)1小時以進行蛋白質(zhì)樣本的烷化。所述反應(yīng)是以加入40mM DTT并接著培養(yǎng)1小時 所終止。接著，進行胰蛋白酶分解之前加入25mM ABC。蛋白質(zhì)樣本隨即以0.2 yg胰蛋白酶 (Promega)處理整夜。在進行LC-MS/MS分析前，將前述分解的蛋白質(zhì)樣本干燥并再溶解于 20 y L水。在抗體上N-聚糖類的指定方面，將所測得的經(jīng)胰蛋白酶分解的抗體的質(zhì)量與一 結(jié)合預(yù)測的胰蛋白酶分解勝肽及N-鏈接聚糖類的數(shù)據(jù)庫比對。以MS/MS光譜上出現(xiàn)的糖 片段確認(rèn)所指定之糖勝肽。在PNGase分解方面，LM52以PNGase F(New England Biolabs) 處理整夜。
[0131] 6.統(tǒng)計學(xué)分析
[0132] 圖52與53顯示的抗體功效差異評估是利用6抑口11?3(1?1^8111￥5.03軟件進行50% 與80 %抑制濃度之參數(shù)（Students配對t檢定）分析。若P < 0. 05,代表具有統(tǒng)計學(xué)上顯 著差異。
[0133] 結(jié)果
[0134] 實施方式1.
[0135] 一組118株病毒分離株之序列分析顯示ibalizumab抗性與gpl20 V5環(huán)狀結(jié)構(gòu)潛 在的 N-鏈接聚糖化位點（potential N-linked glycosylation sites，PNGS)的數(shù)目有關(guān) (Pace et al. , J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Epub ahead of print:Sept. 2012) 〇 如圖 1所示，V5中具有兩個N-連結(jié)聚糖化位點的病毒對于ibalizumab有敏感性，而V5中不具 N-連結(jié)聚糖化位點之病毒則具有抗性。橫條代表中位數(shù)。有趣的是，因ibalizumab單一藥 物治療而發(fā)展出抗性的臨床病毒分離株亦顯示缺少潛在的V5聚糖化位點（Toma et al.，J. Virology 85 (8):3872-2880, 2011)〇
[0136] 在所述組的一株野生型病毒（AC10. 0. 29)，其V5中具有二個N-連結(jié)聚糖化位點并 自然對于ibalizumab有敏感性。利用定點突變有系統(tǒng)地刪除此病毒的V5 N-鏈接聚糖化 位點，所得的突變體病毒對于ibalizumab變得有抗性（見圖2)。
[0137] 在所述組的另一野生型病毒（RHPA4259. 7)，其V5中不具N-連結(jié)聚糖化位點并自 然對于ibalizumab有抗性。所述病毒被修飾以將N-連結(jié)聚糖化位點有系統(tǒng)地加入V5。如 圖3所示，所得之突變體病毒對于ibalizumab變得有敏感性。
[0138] Ibalizumab、0)4及HIV gpl20之重迭晶體結(jié)構(gòu)分析顯示該gpl20 V5環(huán)狀結(jié)構(gòu) 系相鄰于ibalizumab輕鏈與⑶4之間的交互作用位點。其他模型分析顯示ibalizumab 正常而言可經(jīng)由位組抑制HIV，而gpl20 V5上糖的缺少可允許病毒繞過此位組并躲避該 ibalizumab之抗HIV活性。本發(fā)明假設(shè)在ibalizumab上接近gpl20 V5的位點（例如， V5N端附近）附加N-連結(jié)聚糖位點可使經(jīng)修飾的ibalizumab能中和正常情況下具有ibalizumab抗性的病毒。下列實驗是為了驗證此假設(shè)所進行。
[0139] 根據(jù)ibalizumab-⑶4復(fù)合體之晶體結(jié)構(gòu)，基于其與gpl20V5假定的接近的距離 選擇數(shù)個ibalizumab輕鏈的胺基酸位點。那些胺基酸位點包括30E、67、65、52、53、54、60 及76,其編號是根據(jù)不具19個胺基酸信號序列（也就是一前導(dǎo)序列（leadersequence)) 的成熟型輕鏈，并遵照Kabat與Chothia編號方法其亦計算原始編號未計算的胺基酸殘基。 舉例而言，位置「30E」是指原始位置編號為30與31之間的一段胺基酸（30A、30B、30C、30D、 30E、…）中的第5個胺基酸。將潛在的N-連結(jié)聚糖化位點導(dǎo)入這些位置的每一者（圖 4A)。如圖4B所示，突變體輕鏈之分子量皆高于野生型輕鏈（上面部分），顯示這些突變體 存在有附加的糖。當(dāng)以去糖基化試劑PNGaseF處理突變體輕鏈時（下面部分），其分子量 降至正常ibalizumab野生型輕鏈之大小。這些數(shù)據(jù)證實，N-鏈接聚糖化位點確實被附加 在突變體輕鏈。
[0140] 實施方式2.Ibalizumab變體之設(shè)計
[0141] Ibalizumab抗性HIV-1病毒株的研究顯示其抗性主要是來自HIV-1包膜gpl20 V5 環(huán)狀結(jié)構(gòu)糖類的缺少。為了進一步探究V5糖基化在ibalizumab易感受性的角色，本發(fā)明 利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（登錄號2NXY與302D)所報告的結(jié)構(gòu)仿真gpl20、⑶4與ibalizumab之 間的交互作用。該V5 N端糖位點最靠近ibalizumab L鏈（圖5A)，而該V5C端糖則較遠(yuǎn)離 ibalizumab (圖5B)。此模型提供一可能性，也就是將N端糖置入gpl20與ibalizumab之 間的空間會對gpl20施加質(zhì)量效應(yīng)，因此破壞HIV-1進入標(biāo)的細(xì)胞所必需的構(gòu)象變化（扭 型及彎曲）。此模型亦顯示將類似大小的糖導(dǎo)入ibalizumab L鏈可提升其抑制缺少V5N 端糖的HIV-1病毒株的進入的能力。
[0142] 因此本發(fā)明將PNGS導(dǎo)入ibalizumabL鏈可變區(qū)之殘基（30E、52、53、54、60、65、 67及76)，那些殘基靠近gpl20V5環(huán)狀結(jié)構(gòu)。那些ibalizumabL鏈突變體（LMs)是經(jīng)構(gòu) 建、定序及轉(zhuǎn)染至293A細(xì)胞以產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。本發(fā)明以蛋白質(zhì)-A瓊脂糖層析法純 化變體mAbs，并以SDS-PAGE分析（圖6A)。于293A細(xì)胞短暫表達LMs的產(chǎn)率可與野生型 ibalizumab的產(chǎn)率相比較（數(shù)據(jù)未顯示）。每一LMs相較于野生型L鏈可觀察到稍大之L 鏈。為了證實分子量變大是因為糖基化，在變性條件下以PNGaseF處理LMs30E、52與53 并以SDS-PAGE分析（圖6B)。如所預(yù)期的，那些變體的L鏈在PNGaseF處理后分子量減少 成野生型之大小。本發(fā)明接著以質(zhì)譜鑒定在293A細(xì)胞常規(guī)產(chǎn)生的LM52L鏈所導(dǎo)入的N-聚 糖類形式。在L鏈上鑒定出超過六種形式之具有8-12個環(huán)之復(fù)雜型N-聚糖類，所述等形 式中有80%為9-11個環(huán)（圖6C)。將那些LM52突變體以中和試驗檢測，而它們的突變體 差異在于其聚糖的大小。在所有三種受測病毒中，具有較大N-連結(jié)聚糖類的LM52突變體 蛋白質(zhì)被觀察到具有較高的中和活性（圖6D)?？傊?，那些數(shù)據(jù)證實N-鏈接聚糖類被導(dǎo)入 想要的ibalizumabL鏈殘基。
[0143] 實施方式3. LMs之⑶4結(jié)合作用及HIV-1中和作用
[0144] 本發(fā)明接著以表面等離子體共振評估那些ibalizumab LMs對于人類可溶性 ⑶4 (s⑶4)的結(jié)合動力學(xué)。在一使用s⑶4作為分析物的Biacore試驗中，WT ibalizumab 及LMs兩者與sCD4的結(jié)合作用具有類似的結(jié)合動力學(xué)。那些LMs的六者與sCD4的結(jié)合作 用的K D范圍在0. 19nM至0. 8nM間（表1)，而那些數(shù)字在野生型ibalizumab KD的2倍以內(nèi) (0.43nM)。那些數(shù)據(jù)顯示在ibalizumab L鏈的那些特定位點附加N-連結(jié)聚糖不會明顯影 響其結(jié)合CD4的能力。
[0145] 表1 Ibalizumab及其LMs于人類⑶4的結(jié)合動力學(xué)
[0146]
[0147] 本發(fā)明接著探究該LMs相較于WT ibalizumab之HIV-1中和能力。為此，本發(fā)明 檢測該LMs對一組HIV-1病毒的中和能力，那些病毒對于ibalizumab具有抗性或部分抗 性，包括3種具復(fù)制能力型HIV-1病毒株（圖7)。利用這組ibalizumab抗性病毒，當(dāng)WT ibalizumab的測試濃度達到2 y g/mL時，觀察到平均MPI為75%及ICS。為1. 43 y g/mL。四 種LMs(LM30E、LM52、LM53與LM67)觀察到明顯改進之中和活性，其平均MPI為91-99%及 IC S。為0. 05-0. 14 y g/mL(圖7及表2)。其中，LM52似乎有最好的HIV-1中和功效。相較于 ibalizumab，其他兩個變體（LM54與LM65)產(chǎn)生較適度改進的病毒中和活性。有趣的是，該 具有改進HIV-1中和活性之六個LMs的PNGS亦比HIV-1中和活性可比WT ibalizumab的 LM60與LM76之PNGS更靠近gpl20的V5 (459)(表2)。因此，將N-聚糖類置于靠近V5似 乎能改進ibalizumab變體的中和作用的情況。然而，本發(fā)明人注意到除了與V5之距離以 外，聚糖的方向亦可扮演關(guān)鍵角色。
[0148] 表2 Ibalizumab及其輕鏈突變體的比較
[0149]
[0150] 實施方式4.糖之大小影響LM52活性
[0151] 本發(fā)明研究糖的大小是否影響LM