明一實施方式中，一具有CD4結(jié)合親合性之抗-CD4IgG 1抗體被制備并命名為MV1。 該MV1具有IgG 1恒定區(qū)的位置234之白胺酸（leucine)至苯丙胺酸（phenylalanine) 的變更、位置235之白胺酸至麩胺酸（glutamic acid)的變更，以及位置331之脯胺酸 (proline)至絲胺酸（serine)的變更。該MV1的重鏈和輕鏈胺基酸序列分別如SEQ ID NOS:2-3 所示。
[0071] 本發(fā)明一些實施方式中，該抗-⑶4抗體的重鏈Fc區(qū)或FcRn區(qū)可包含一個或一個 以上的修飾以改進抗-CD4抗體的再利用性。一【具體實施方式】為該抗-CD4抗體包含如SEQ ID N0:5所示的重鏈胺基酸序列。
[0072] 本文所公開的聚糖修飾涉及將聚糖類添加于一抗-CD4抗體可變區(qū)的內(nèi)工程化 N-鏈接聚糖化位點。在真核細胞中，聚糖類連接至由核糖體離開的新合成多肽的共有序列 (consensus sequence) Asn-X-Ser/Thr中的天門冬酰胺酸殘基。此種N-連結(jié)聚糖化過程為 一酵素導向過程，其發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)及高爾基體（Golgi apparatus)。為了本發(fā)明之目 的，所述共有序列Asn-X-Ser/Thr中的Asn殘基指的是「N-連結(jié)聚糖化位點」。本領域的技 術(shù)人員可應用多種分子選殖技術(shù)以工程化一抗-CD4單克隆抗體可變區(qū)內(nèi)N-連結(jié)聚糖化位 點，其可包括一個或一個以上的胺基酸之插入、刪除及/或取代以取得共有的N-連結(jié)聚糖 化序列 Asn-X-Ser/Thr。
[0073] -些【具體實施方式】中，一工程化N-鏈接聚糖化位點位于一抗-⑶4單克隆抗體之 輕鏈（VL)V結(jié)構(gòu)域內(nèi)?？煽紤]進行相關(guān)抗體、CD4受體及HIVgpl20蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型分 析以輔助確定抗體內(nèi)的適合或更想要的N-連結(jié)聚糖化位點。如所描繪的，本發(fā)明證實，針 對ibalizumab或其他抗-⑶4抗體，三維結(jié)構(gòu)模型分析可將一 N-連結(jié)聚糖化位點導入與 ⑶4結(jié)構(gòu)域1結(jié)合的HIV gpl20蛋白的V5環(huán)狀結(jié)構(gòu)鄰近的位置。
[0074] -些【具體實施方式】中，一 N-連結(jié)聚糖化位點在ibalizumab之輕鏈胺基酸位置或 其相對應之位置被工程化，那些位置是選自于殘基30E、52、53、54、60、65、67與76,及其組 合。具體而言，所述胺基酸位置是選自于由30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、 67Ser及76Ser所組成群組之位置。根據(jù)本發(fā)明，為了在那些位置導入新的N-鏈接聚糖化 位點，在「30EGln」、「52Ser」、「53Thr」、「54Arg」、「60Asp」、「65Ser」、「67Ser」及「76Ser」代 表的序列中所改變的每一個胺基酸位置顯示如下：
[0075] 30E Gin :30E Gln、31Lys、32Asn 變更為 30E Asn、31Ala、32Thr
[0076] 52Ser :52Ser、53Thr、54Arg 變更為 52Asn、53Ser、54Thr
[0077] 53Thr :53Thr、54Arg、55Glu 變更為 53Asn、54Ala、55Thr
[0078] 54Arg :54Arg、55Glu、56Ser 變更為 54Asn、55Ala、56Thr
[0079] 60Asp :60Asp、61Arg、62Phe 變更為 60Asn、61Ala、62Thr
[0080] 65Ser :65Ser、66Gly、67Ser 變更為 65Asn、66Ala、67Thr
[0081] 67Ser :67Ser、68Gly、69Thr 變更為 67Asn、68Ala、69Thr
[0082] 76Ser :76Ser、77Ser、78Val 變更為 76Asn、77Ala、78Thr 〇
[0083] 本發(fā)明實施方式中，胺基酸位置3(^6111、52561、5311^、54六找、65561及67561的個 別或組合的N-鏈接聚糖化可提供一改進活性。在一特定實施方式中，該胺基酸位置為位置 52Ser。那些胺基酸位置的編號是基于ibalizumab的成熟型輕鏈（不含前面16個胺基酸信 號序列）或其相對應的位置為基準。在特定【具體實施方式】中，在該ibalizumab輕鏈的30E Gln、52Ser、或53Thr之一者是工程化N-鏈接聚糖化位點。在一【具體實施方式】中，該工程化 N-鏈接聚糖化位點位于胺基酸位置52Ser。
[0084] 本發(fā)明之一【具體實施方式】中，一經(jīng)修飾以改進穩(wěn)定性的ibalizumab衍生性IgGl 變體，稱作MV1，是用于產(chǎn)生所述聚糖修飾的抗-CD4抗體。所述MV1的重鏈及輕鏈分別具有 如SEQ ID N0S:2及3所示的胺基酸序列。所述輕鏈的胺基酸位置52具有工程化N-鏈接 聚糖化位點，其具有如SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。所述MV1重鏈的Fc區(qū)或FcRn區(qū) 可具有進一步的修飾以改善抗體的再利用性。本發(fā)明的一【具體實施方式】是提供一具有改進 活性及穩(wěn)定性的聚糖修飾的抗-CD4抗體，包含如SEQ ID NO: 4所述之輕鏈胺基酸序列及如 SEQ ID NO:5所述之重鏈胺基酸序列。
[0085] 一旦抗-⑶4單克隆抗體可變區(qū)內(nèi)之N-連結(jié)聚糖化位點被工程化，利用適當?shù)闹?組表達系統(tǒng)可輕易產(chǎn)生此類抗體之聚糖修飾形式。舉例而言，可將編碼抗-CD4抗體輕鏈之 表達載體轉(zhuǎn)染至一適合抗體分子重組表達及能產(chǎn)生N-連結(jié)聚糖化之細胞株，其中該輕鏈 的至少一可變結(jié)構(gòu)域經(jīng)工程化以納入N-連結(jié)聚糖化位點。可收取含抗體的培養(yǎng)基上清液 并進行任何適當?shù)膶游龇ㄒ匀〉脤嵸|(zhì)上純化的抗體制備物。
[0086] 本領域的技術(shù)人員容易取得適合抗體分子重組表達的細胞株，且一般而言能進 行N-連結(jié)聚糖化。在真核生物中，所述N-連結(jié)聚糖化過程在轉(zhuǎn)譯作用時共同發(fā)生且該 初始步驟發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔面（luminal side)，其涉及將一 61〇3]\&111961〇嫩〇2寡糖運送 至新生多肽鏈。此前驅(qū)物結(jié)構(gòu)隨即進一步經(jīng)一系列的糖苷酶（glycosidases)及糖基轉(zhuǎn) 移酶（glycosyltransferases)修飾。在以葡萄糖苷酶I與II移除三個葡萄糖殘基后， 以甘露糖苷酶I移除一特定的終端a-1，2-甘露糖。所述那些反應在最低等與最高等 真核生物之間具有高度保留性。此時，正確折迭的Man sGlcNAc2 N-連結(jié)糖化蛋白可離開 聚糖化機構(gòu)；或者，其可繼續(xù)并進行進一步的物種及細胞類型特異性加工，經(jīng)由一系列的 酵素催化以產(chǎn)生雜合體及/或復合體類型之聚糖類。請見圖7A。亦請見例如，Wright 與Morrison, TIBTECH 15:26-32(1997)之回顧；美國專利號6, 602, 684 ;以及美國專利號 7, 029, 872,在此通過引用并入本案以作為參考文獻。在高等真核生物中，進一步以數(shù)個 a -1，2_ 甘露糖昔酶（a -1，2-mannosidases)修整 Man8GlcNAc2結(jié)構(gòu)。隨后，于 GlcNAc 轉(zhuǎn) 移酶I(GlcNAc transferase I，GnT-I)催化之反應中加入0-1，2-連結(jié)61〇嫩(：殘基以修 飾所得之Man5GlcNAc 2 N-連結(jié)聚糖類，該所得的GlcNACMsGlCNAc2結(jié)構(gòu)導致最終「雜合體 類型」N-連結(jié)聚糖類之形成?；蛘?，以甘露糖苷酶II(mannosidase II，Man-II)作用于 GlcNAcMsGlcNAc2結(jié)構(gòu)，移除二個甘露糖，并隨后以GnT-II加入第二個f3-l，2-GlcNAc。所 得之聚糖類結(jié)構(gòu)稱作「復合類型」N-連結(jié)聚糖類，其中以至少一 GlcNAc殘基修飾兩個核 心-a -甘露糖殘基?？山逵蒅nT-IV、GnT-V及GnT-VIs附加至其他分支。半乳糖及唾液酸 殘基進一步分別以半乳糖轉(zhuǎn)移酶及唾液酸轉(zhuǎn)移酶附加。
[0087] 根據(jù)本發(fā)明，附加至抗-⑶4抗體可變區(qū)之N-連結(jié)聚糖類應包括至少7、8、9、10、11 或12個糖單元或「環(huán)」。本文使用的術(shù)語「糖單元」是指個別之糖分子彼此連接以于真核細 胞形成原始N-聚糖類；也就是說，其包括葡萄糖、甘露糖、N-乙?；咸烟前?、半乳糖及唾 液酸。該抗體的N-聚糖類之確切結(jié)構(gòu)（亦即，其組成和一系列的連接）未必完全關(guān)鍵，只 要該N-聚糖類包括至少7個單元。N-鏈接聚糖類之實例包括那些典型可見于哺乳類動物 細胞的，例如，Man 8GlcNAc2(末端的 GlcNAc 連接至 Asn)、Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc 2、 GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal 2GlcNAc2Man3GlcNAc2、（唾液酸） 2GlcNAc2Man3GlcNAc2、 GalGlcNAcMan 5GlcNAc2，以及美國專利號6, 602, 684所公開的二等分（bisected)雙鏈復合 體、三鏈復合體、三'鏈（tri'-antennary)復合體及四鏈復合體N-聚糖類（例如，請見該說 明書之圖1)，在此通過引用并入本案以作為參考文獻。
[0088] 根據(jù)本發(fā)明，適用于聚糖修飾抗體重組表達的細胞株為真核細胞，尤其是包括哺 乳類動物細胞株如中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CH0)細胞、幼倉鼠腎臟（Baby Hamster Kidney，BHK)細胞、（鼠骨髓瘤）NS0細胞、鼠骨髓瘤SP2/0細胞、人類胚胎腎臟 293 (HEK293或293)細胞、小鼠胚胎纖維母細胞3T3,及其衍生的細胞株，只要衍生的細胞可 有效表達具有N-連結(jié)聚糖化的重組型抗體。該等細胞有許多可購自美國組織培養(yǎng)保存中 心（American Tissue Culture Collection，ATCC)或商業(yè)管道?；蚋脑旒毎a(chǎn)生具有聚 糖形式改變的糖蛋白，例如，具有特定類別的N-連結(jié)聚糖類（例如，雙鏈復合體N-連結(jié)寡 糖）并以二等分N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc)修飾的糖蛋白，如美國專利號6, 602, 684所公 開的，在此通過引用并入本案以作為參考文獻，亦可用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。其他適用的真 核細胞可包括昆蟲細胞及酵母菌細胞，例如面包釀酒酵母菌（S. cerevisiae)及嗜甲醇酵 母菌（Pichia pastoris)，包括具體而言基因改造酵母菌株以產(chǎn)生具有人類N-聚糖類形式 的蛋白質(zhì)。請見，例如，美國專利號7, 029, 872及美國專利號7, 449, 308,兩者在此通過引用 并入本案以作為參考文獻。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明之實施方式，以酵素（例如，PNGase)處理分離自細胞培養(yǎng)基的抗 體分子可將該N-連結(jié)聚糖類連接至細胞所生產(chǎn)的抗體分子。經(jīng)前述處理所造成的抗體 表觀分子量改變（其可由SDS-PAGE、西方墨點法，及其類似物檢測）顯示N-鏈接聚糖類 確實連接至抗體分子。N-連結(jié)聚糖類的分子量大小可以通過與已知分子量大小之N-連 結(jié)聚糖類相比較來估計而得。在更詳盡的分析方面，可藉由例如DNA定序儀輔助（DNA sequencer assisted，DSA)，焚光團輔助糖電泳法（fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis，F(xiàn)ACE)，或MALDI-T0F MS分析連接至抗體之N-連結(jié)聚糖類，所有這些技 術(shù)于本領域皆有完整文獻。舉例而言，于一 DSA-FACE分析中，N-連結(jié)聚糖類是從聚糖化的 抗體勝肽釋出：以N-糖苷酶F(PNGase F)處理。該釋出的N-連結(jié)聚糖類隨即于還原氨化 反應中以焚光團 8-氨基花-1，3, 6-三橫酸鹽（fluorophore 8-aminopyrene-l，3, 6-trisu lfonate，APTS)進行衍生化。移除多余的APTS之后，以一 ABI 3130DNA定序儀分析經(jīng)標記 的N-鏈接聚糖類。請見，例如，Laroy等人（Nat Protoc. 1:397-405(2006))，美國專利號 6, 602, 684公開的重組所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的N-連結(jié)聚糖類MALDI-T0F MS分析，在此并入本案 以作為參考數(shù)據(jù)。
[0090] 可由多種功能性試驗評估聚糖修飾抗體以確認其中和HIV的功效，包括測定抗體 對于一大組病毒分離株的廣度及效力的試驗，如實施方式一節(jié)所述。
[0091] 本發(fā)明的【具體實施方式】中，可確認的是一 gpl20N端之糖填補一 ibalizumab輕鏈 與gpl20 V5之間空出的空間，且ibalizumab對于HIV-1進入的作用是由此糖的空間上 的質(zhì)量效應所調(diào)節(jié)。在檢測輕鏈具有不同PNGS位置的一組ibalizumab突變體對于體內(nèi) 中和HIV-1感染性的能力方面，發(fā)現(xiàn)在位于ibalizumab-⑶4-gpl20復合體V5附近之含 糖ibalizumab突變體可有效中和HIV-1。那些ibalizumab突變體亦可中和具有野生型 ibalizumab抗性之HIV-1病毒株。在本發(fā)明的一【具體實施方式】中，一 ibalizumab的突變 體LM52可100%中和受測之118株HIV-1分離株，其效用高于野生型ibalizumab十倍以 上，此測試以IC S。幾何平均值判定，也就是所述抗體濃度